Aula - Microscopia eletrônica

      Aula teórica 2 - Microscopia eletrônica

Nesta aula vimos outra ferramenta necessária para o estudo da microbiologia, o microscópio eletrônico. Sua história se inicia com o experimento de Hans Bush em 1926 que mostrou ser possível focalizar um feixe de elétrons utilizando uma lente magnética circular (isto mesmo! as "lentes" dos ME são campos magnéticos que "afilam" e direcionam o feixe de elétrons). Utilizando o princípio desde experimento, em 1932, o físico Ernst Ruska e o engenheiro Max Knoll criaram o primeiro microscópio eletrônico. Em 1933, o limite de resolução do ME já ultrapassava a do microscópio de luz, porém seu pleno desenvolvimento só aconteceu após a segunda guerra mundial, quando então  surgiu o Elmskop I, construído por Ernst Ruska e Bon von Bonier nos laboratórios da Siemens.
     

Elmskop I

     A utilidade do ME é enorme e fornece uma comprovação fotográfica de organismos e características subcelulares, sendo uma técnica de custo relativamente baixo além de ser rotineira e rápida execução. Os objetos de estudo da ME são os mais variados: estudo ultraestrutural de células vegetais e animais, fungos, bactérias, fitoplasma, virus, viróides, artrópodes, peças automotivas, papéis, exames de balística e outros...
     
     Para entendermos a grande diferença entre microscopia óptica e microscopia eletrônica precisamos primeiro precisamos entender como a imagem é formada em ambos os casos. No microscópio óptico usamos um feixe de luz para visualizar os objetos. A luz é emitida através da fonte, passa pelo condensador, atravessa a amostra, as lentes e chega no olho do observador (imagem a direita). É por usarmos um feixe de luz que podemos visualizar amostras coloridas mas também é o que restringe o aumento máximo possível do microscópio de luz a 1000x (o aumento que usamos para visualizar bactérias nas aulas práticas). Não é possível ultrapassar muito este valor pois a cada aumento o orifício da lente se torna menor e isto restringe a passagem do feixe de luz. Pois então se o microscópio óptico utiliza luz, o microscópio eletrônico utiliza elétrons. Sim! um feixe de elétrons como dito no início do texto. Um feixe de elétrons é muito menor que o comprimento de onda da luz e utilizando esta técnica foi possível atingir outros níveis aumento.  O poder de resolução é a menor distância com a qual vc consegue enxergar dois pontos distintos como pontos separados.  O poder de resolução do olho humano desarmado é de 0,1mm, então quer dizer que o olho humano é capaz de distinguir dois pontos separados por uma distância mínima de 0,1mm (ou 100um - micrômetros). Se a distância for menor que esta, a imagem de um ponto se sobrepõe à do outro e vc não consegue ver os pontos separadamente. O microscópio de luz tem um poder de resolução de 150 a 200nm (ou 0,15um a 0,2um - nanômetros), o microscópio eletrônico de transmissão (MET) alcança 1 a 2 angstrons  (0,1nm a 0,2nm) e,  por fim, o microscópio eletrônico de varredura(MEV) atinge 4 a 5 angstron (0,4nm a 0,5nm).
         Bom, agora que citamos os dois tipos de ME vamos falar um pouco sobre eles. Ambos utilizam feixes de elétrons mas de maneiras diferentes. O MET transmite o feixe de elétrons com uma certa aceleração para que os elétrons ultrapassem a amostra, que foi previamente por seccionada por um ultramicrótomo (cortes de no máximo 70nm) e foi pulverizada com diferentes metais (variam de acordo com a amostra e seus compostos químicos). Os elétrons vão se comportar de maneira diferente de acordo com os metais nas amostras, alguns ficando retidos, outros passando direto e com velocidades diferentes. Então um detector de elétrons os recebe e transmite para tela em forma de imagem com tons de cinza. Uma característica própria do MET (abaixo) é de ter uma coluna de alto vácuo alta, isso para que os elétrons tenham espaço para acelerar o suficiente para gerar uma imagem ao se chocar com a amostra. Mas todo cuidado é pouco, se acelerar demais a amostra pode ser rasgada!

Funcionamento do MET

        O ME de varredura usa o feixe de elétrons de maneira diferenciada. O feixe é menos acelerado e "varre" a superfície da amostra que também deve estar revestida com um metal (ouro, chumbo, etc). Os elétrons colidem com a amostra e alguns são refletidos. Neste processo, existe um detector que analisa a velocidade, ângulo e direção dos mesmos e através deste parâmetros, uma imagem é gerada. Um detalhe que difere do MET é a coluna de alto vácuo, que para o MEV é baixa pois os elétrons não podem acelerar muito para não destruir a amostra.
       A diferença no uso do feixe proporciona diferentes tipos de imagem. As imagens do MEV são tridimencionais, é possível ter noção do volume e é possível visualizar a superfície das amostras, ao passo que o MET fornece imagens planas, é possível visualizar o interior das células e é possível analisar a sua área. Como cada microscópio tem sua função então, na pesquisa, eles devem andar em paralelo para comprovação do que se esta sendo visualizado.  

Célula vista em MEV

Mitocôndria em MET

             Para finalizar deixamos algumas perguntas:
1) para que serve o vácuo?
2) por que revestimos os materiais observados com metais?
3) como o feixe de elétrons é gerado?
4) por que seccionar (cortar) o material na microscopia de trasnmissão?
5) de que é feito um ultramicrótomo?


e também o endereço onde estão os pdfs das aulas :
http://www.lfn.esalq.usp.br/mapoio/?i=1&i_=1&d=graduacao&folder=LFN-0321-T&disc=MICROBIOLOGIA - teórica
http://www.lfn.esalq.usp.br/mapoio/?i=1&i_=1&d=graduacao&folder=LFN-0321-P&disc=MICROBIOLOGIA  - prática

Aloha!

Raphael e Aranha